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    質(zhì)粒圖譜

    發(fā)布時(shí)間: 2024-06-24  點(diǎn)擊次數: 207次

    質(zhì)粒圖譜為質(zhì)粒DNA序列的物理圖譜,提供了包括質(zhì)粒的大小、篩選標記、克隆位點(diǎn)、轉錄及翻譯元件等信息,為我們選擇質(zhì)粒、了解質(zhì)粒特點(diǎn)及應用提供了重 要依據。對于初學(xué)者來(lái)說(shuō)該如何去閱讀質(zhì)粒圖譜呢?今天來(lái)給大家講解一下如何閱讀質(zhì)粒圖譜及構建質(zhì)粒圖譜。


    質(zhì)粒的組成要素有哪些

    1. 復制起始位點(diǎn):Ori即控制復制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復制起點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復制起始位點(diǎn)。

    2. 抗生素抗性基因:可以便于加以檢測,如Amp+ ,Kan+。

    3. 多克隆位點(diǎn)MCS:克隆攜帶外源基因片段。

    4. P/E 啟動(dòng)子/增強子

    5. Terms 終止信號

    6. 加poly(A)信號:可以起到穩定mRNA作用

    質(zhì)粒圖譜


    如何閱讀質(zhì)粒圖譜

    第一步:首先看 Ori 的位置,了解質(zhì)粒的類(lèi)型(原核/真核/穿梭質(zhì)粒)。

    第二步:再看篩選標記,如抗性,決定使用什么篩選標記。

    1.Ampr 水解 β-內酰胺環(huán),解除氨芐的毒性。

    2.tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細胞。

    3.camr 生成氯霉素羥乙?;苌?,使之失去毒性。

    4.neor(kanr) 氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418(卡那霉素衍生物衍生物)失活。

    5.hygr 使潮霉素 β 失活。

    第三步:看多克隆位點(diǎn)(MCS)。

    它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入,會(huì )導致某種標志基因的失活,而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

    第四步:再看外源DNA插入片段大小。

    質(zhì)粒一般只能容納小于 10 Kb 的外源 DNA 片段。一般來(lái)說(shuō),外源 DNA 片段越長(cháng),越難插入,越不穩定,轉化效率越低。

    第五步:是否含有表達系統元件,即啟動(dòng)子-核糖體結合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉錄終止信號。

    這是用來(lái)區別克隆載體與表達載體??寺≥d體中加入一些與表達調控有關(guān)的元件即成為表達載體。選用哪種載體,還是要以實(shí)驗目的為準繩。

    啟動(dòng)子-核糖體結合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉錄終止信號

    啟動(dòng)子-促進(jìn) DNA 轉錄的 DNA 順序,這個(gè) DNA 區域常在基因或操縱子編碼順序的上游,是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開(kāi)始轉錄的部位,但啟動(dòng)子本身不被轉錄。

    增強子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉錄過(guò)程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無(wú)關(guān)。即在所調控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子-負增強子,負調控序列。

    核糖體結合位點(diǎn)/起始密碼/ SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖體的兩個(gè)結合位點(diǎn),對于原核而言是 AUG(起始密碼)和 SD 序列。

    轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子:結構基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列,此位點(diǎn) down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區,這 2 部分共同構成 poly(A)加尾信號。結構基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列,此位點(diǎn) down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區,這 2 部分共同構成 poly(A)加尾信號。


    第六步:質(zhì)粒圖譜上的箭頭。

     有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針,那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈,即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA,它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上。


    質(zhì)粒構建以及需要注意的事項:

    1.載體構建

     載體構建(vectorconstruction):載體構建是分子生物學(xué)研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點(diǎn)(MCS)的改造和已有載體啟動(dòng)子、增強子、篩選標記等功能元件的改造。是為把DNA分子運送到受體細胞中去,必須尋找一種能進(jìn)入細胞、在裝載了外來(lái)的DNA片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質(zhì)粒(plasmid),在基因工程中,常用人工構建的質(zhì)粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質(zhì)粒。

     特點(diǎn):當給質(zhì)粒插入一段外源DNA片段后,它依然能夠進(jìn)行自我復制。


    2.多克隆位點(diǎn)

     多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site, MCS),指的是包含數個(gè)(最多20個(gè))限制性酶切位點(diǎn)(restriction site)的一段很短的DNA序列。也稱(chēng)為多位點(diǎn)接頭(polylinker),是基因工程中常用到的載體質(zhì)粒的標準配置序列。MCS上含有多個(gè)單一酶切位點(diǎn),是外源DNA的插入部位,每個(gè)限制性酶切位點(diǎn)通常是十分奇特的,即它們在一個(gè)特定的載體質(zhì)粒中只出現一次。不同酶的酶切位點(diǎn)可有重疊。單一酶切位點(diǎn)就是只有一種特定的酶能夠識別并進(jìn)行酶切的位點(diǎn),多克隆位點(diǎn)一般是位于質(zhì)粒上的一段序列,這段序列含有很多個(gè)酶切位點(diǎn),但這些酶切位點(diǎn)每一個(gè)都被一種酶識別并酶切。

     

    3.質(zhì)粒構建

    (1)質(zhì)粒構建原理


    質(zhì)粒構建是分子生物學(xué)研究中經(jīng)常使用的實(shí)驗技術(shù)。原理依賴(lài)于限制性核酸內切酶,DNA連接酶和其他修飾酶的作用,分別對目的基因和載體DNA進(jìn)行適當切割和修飾后,將二者連接在一起,再導入宿主細胞,實(shí)現目的基因在宿主細胞內的正確表達。


    (2)質(zhì)粒構建方式

    質(zhì)粒構建方式多樣,常規的T4連接酶,下面就介紹下T4連接酶構建質(zhì)粒方法,T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接,但一般推薦適用黏性末端。


    (3)質(zhì)粒載體的制備

    質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切,一般推薦使用雙酶切。其實(shí)目的就只有一個(gè),盡量使載體的末端具有特異性,防止自連。


    質(zhì)粒圖譜

    圖 質(zhì)粒圖譜

    4.一般目的基因用于克隆表達的情況下,酶切位點(diǎn)的選擇要考慮到:

       (1)選擇質(zhì)粒上兩個(gè)酶切位點(diǎn)的距離不應小于太?。?gt;10bp),否則影響限制性?xún)惹忻笇η悬c(diǎn)的識別,不利于空載體的雙酶切;

        (2)一般目的基因用于克隆表達的情況下,酶切位點(diǎn)的選擇要考慮到:

    目的基因片段內部不含有所選的酶切位點(diǎn)(不然鑒定陽(yáng)性重組子雙酶切時(shí)會(huì )將目的基因切斷)。

    (3)實(shí)驗后繼應用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲(chóng))都盡可能含有所選的酶切位點(diǎn)。并且要保證在載體上的插入方向正確(定向克?。?。(不然換載體表達時(shí),還要重新設計引物,以引進(jìn)新的酶切位點(diǎn))。

    (4)盡可能選比較常用的酶切位點(diǎn)(常用切點(diǎn)酶的價(jià)格比較便宜)。

    (5)兩個(gè)酶切點(diǎn)至少隔上3個(gè)堿基。

    (6)兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶(切下來(lái)的殘基不要互補),否則效果相當于單酶切。

    (7)最好使用酶切效率高的酶。

    (8)最好使用雙酶切有共同buffer的酶。


    注:質(zhì)粒構建完成后可利用PCR原理進(jìn)行測序驗證。


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